IQ2000^TMKit

IQ REAL System

最新消息

病毒資訊

服務項目

技術支援

關於我們

全球代理

首       頁

有時無法從陰性檢體得到宿主基因的亮帶，這情況要如何改進？

首先應檢視陽性標準品的反應是否正常，如果陽性標準品也沒有形成任何亮帶，表示PCR反應失敗，這時需檢查PCR的步驟。如果陽性標準品的反應正常，則主要就應是DNA品質的問題。

接著應檢查是否選擇了不適當的DNA萃取方式，如Lysis Buffer只適用於萃取腹足(泳足)、肌肉或PL15以下(包括nauplii和mysis)的樣品。如果使用Lysis Buffer萃取其他種類的樣品，如：PL20、肝胰腺等，將無法形成宿主基因的亮帶。

第三，如果已使用適當的DNA萃取方式，那問題就可能是肇因於DNA濃度和DNA與蛋白質的比率，此時可用分光光度計測量DNA樣品的OD260和OD260/280的比值，以得知DNA濃度和DNA與蛋白質的比率。或是將DNA樣品以ddH2O做五倍稀釋後，重新進行PCR反應，如果稀釋後即可得到宿主基因的亮帶，表示原來的DNA或蛋白質濃度太高；如果稀釋後仍然沒有形成宿主基因的亮帶，則表示DNA原濃度可能太低，因此在萃取時應使用較少的ddH2O來溶解DNA沈澱物。

回到 Q&A

為何有時電泳凝膠片上會形成一片模糊(smear)，且沒有產生清楚的亮帶？是 由什麼原因造成的？

太多的DNA、蛋白質和太強的非專一性反應都會導致電泳凝膠片上的結果呈現模糊，經EtBr染色後太強的背景值也會增強模糊的現象。實際上，輕微的模糊對PCR反應而言是正常的，尤其是多對引子(multi-primer)的PCR系統。此時可藉由在一開始調整DNA的濃度，並增加電泳凝膠片放置在清水中去背景的時間，或可在進行電泳時改用較薄的電泳凝膠片等方式，來改善電泳凝膠片上形成一片模糊的情況。如果在使用上述方法之後，形成模糊的情況仍然很嚴重，甚至影響結果的判讀時，那造成模糊的原因應該是來自於非專一性反應，這時就該檢查樣品，並探討非專一性反應是由何處產生。

回到 Q&A

為何有時會產生非專一性的亮帶呢？

非專一性亮帶通常由宿主基因引子不正確的擴增反應所造成的，因為我們以蝦最保守(conserved)的基因片段來設計宿主基因，大部分的甲殼類動物都有這個具高度同源性的基因，不過它的大小可能會有些許不同。PCR是非常靈敏的方式，即使是非常微量的模版，都能成功的進行擴增反應。例如：在檢測PL時，如果PL吃了其他微小的甲殼類，這些被吃的甲殼類的DNA也會一起被萃取，從這類樣品中就會得到不同大小的宿主基因反應產物。

因為形成這些非專一性亮帶的產物大小明顯與專一性亮帶不同，所以並不會影響結果的判讀

回到 Q&A